Resumen
Las enfermedades periodontales son un emergente problema mundial a nivel de salud humana. Décadas de investigaciones, evidencian que en la mayoría de los casos la periodontitis crónica es la más común, caracterizada por ser de evolución lenta, pérdida de inserción, bolsas patológicas y reabsorción ósea, la cual puede llevar a la pérdida dentaria. Si bien se reconoce el origen multifactorial en el desarrollo de la periodontitis, es relevante la articipación de la microbiota subgingival en la etiología de la enfermedad periodontal. Algunas de las especies bacterianas patógenas que han sido asociadas con el desarrollo de la enfermedad periodontal son Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Fusobacterium nucleatum, entre otras. Palabras claves: microbiota, prevalencia, periodontitis crónica, metagenómica, multiplex-PCR Objetivos : En este estudio, observacional, analítico y descriptivo nos propusimos investigar cuáles de éstas cinco especies estaban presentes en las bolsas periodontales de 51 pacientes uruguayos con periodontitis crónica. Para alcanzar este objetivo se utilizó una técnica convencional microbiológica y metagenómica (multiplex-PCR) Metodología Selección de pacientes: Se seleccionaron 51 pacientes = 30 años (23 mujeres y 28 hombres) con periodontitis crónica moderada (PIC =3-4mm) y avanzada (PIC = 5mm), sangrado al sondaje, bolsas patológicas y pérdida ósea, cuyo diagnóstico periodontal fue realizado de acuerdo a los parámetros de la Academia Americana de Periodoncia (AAP) (Armitage et al, 1999), con al menos 12 dientes presentes excluyendo el tercer molar, sin previo tratamiento periodontal; pacientes libres de diabetes, artritis, colitis ulcerativas, VIH, cáncer y enfermedades del corazón. Tampoco incluyeron en este estudio a pacientes con periodontitis inicial, (pacientes con pérdida de inserción clínica entre 1 a 3 mm) mujeres embarazadas, ni aquellos que recibieron dos meses antes , tratamientos con antibióticos y/o antiinflamatorios. Todos los pacientes fueron informados de la investigación y aceptaron firmar en presencia de un testigo un consentimiento, de acuerdo a las Normas del MERCOSUR. El comité de ética de la Facultad de Odontología UDELAR, aprobó el diseño del estudio basándose en la normativa MERCOSUR y la Declaración de Helsinki sobre la experimentación en la cual participan seres humanos. Muestras :Se seleccionaron 4 sitios en cada cuadrante basándose en el estudio clínico y radiográfico. Con profundidad de bolsa = 5.0 mm y pérdida ósea de = 2.0 mm. Se removió la placa supragingival evitando sangrado usando gasa estéril, se secó con rollos de algodón estériles. Se introdujeron las puntas estériles de papel medianas (N§25) en lo más profundo de la bolsa y se dejaron durante 15 s. Se colocaron en 1.5 ml de RTF(Reduced Transport Fluid) (Syed et. al., 1972). Cada muestra presentaba 8 puntas de papel que fueron procesadas inmediatamente. El procedimiento consistió en la agitación rigurosa durante 45 - 60 s y posteriormente se realizaron diluciones seriadas en RTF.Se tomaron 100 ul de la muestra y se colocaron en un eppendorf con 900 ul de RTF. (1§ dilución: 1:10).De esta se sembró 100 ul ,expandiendo la muestra con una varilla de vidrio sobre una placa de TSVB: tripticasa soya, bacitracina (75 µg/ml), vancomicina (5.0 µg/ml), 10 ml de suero de caballo (10 porciento) , para el aislamiento de Aggregatibacter actinomycetemcomitans . Se colocaron las placas en jarra con vela incubándola durante 7 días a 37§C.Se tomaron 100 ul de la muestra original de RTF, se colocaron en 900 ul de RTF. Se tomaron 100 ul de éste tubo y se colocaron en otro con 900 ul (2ª dilución: 1:100).Se tomaron 100 ul y se sembraron en medio agar base con sangre con menadiona y hemina, y se incubaron durante 14 días a 37§C en anaerobiosis estricta.De las muestra en RTF se tomaron 500 µl, se almacenaron a -30§C y luego fueron utilizadas en los multiplex-PCR . Resultados :Los resultados de la técnica convencional microbiológica evidenciaron la presencia de A. actinomycetemcomitans (33 porciento) y de bacterias negras pigmentadas anaerobias (100 porciento) en las muestras. De los resultados obtenidos en la multiplex-PCR, se demostró que las especies de mayor prevalencia fueron F. nucleatum (100 porciento), T. forsythia (92 porciento) y P. gingivalis (88 porciento). Por el contrario, las especies de menor prevalencia fueron P. intermedia (39 porciento) y A. actinomycetemcomitans (33 porciento) Conclusiones: En las muestras obtenidas de los 51 pacientes con periodontitis crónica , mediante la técnica microbiológica convencional, se aislaron bacterias negras pigmentadas anaerobias en el 100 porciento de las mismas, y el análisis de las secuencias especie-específicas a nivel del ARN ribosomal 16S por mutiplex-PCR, permitió la rápida detección a nivel de especie de cinco patógenos periodontales. Dentro de las especies bacterianas identificadas F. nucleatum, fue el único patógeno periodontal que se detectó en todos los pacientes de ambos sexos (fumadores y no fumadores).De la población uruguaya estudiada con periodontitis crónica ,las especies patógenas con mayor prevalencia fueron F. nucleatum, T. forsythia y P. gingivalis.(AU)
